La pleuroneumonía contagiosa porcina (PCP) es causada por el Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae). Se trata de una enfermedad que puede tener varios cursos (sobreagudo, agudo, subagudo y crónico) y el impacto de esta enfermedad radica en el aumento de la mortalidad, aumento de los costos por tratamientos y/o vacunación y el decomiso en matadero. Una de las primeras descripciones del agente fue realizada en 1964 en un brote en Argentina, aunque existen informes anteriores. Primariamente se lo denominó Haemophilus pleuropneumoniae o Haemophilus parahemolyticus. Posteriormente el microorganismo fue transferido al género Actinobacillus y fue designado con el nombre de Actinobacillus pleuropneumoniae después de estudios de homología de ADN que demostraron una relación cercana con otros miembros de especie Actinobacillus.

La distribución de los serotipos de A. pleuropneumoniae no están distribuidos geográficamente igual. En Latinoamérica y el Caribe han sido informado los serotipos 1, 3-6-8, 4, 5a,  5b,  7, 12 y 15. Esto es importante ya que existen algunos hechos curiosos al respecto. A pesar del comercio internacional, algunos de los serotipos persisten en un continente y están ausentes en otros, los serotipos que son más prevalentes por serología son a menudo diferentes de aquellos aislados de los animales enfermos, algunos serotipos son más contagiosos que otros. Esto se verá en detalle más adelante.

Signos clínicos

La PCP puede cursar de formas sobreaguda, aguda o crónica. El impacto económico de la enfermedad se debe principalmente en caso de brote agudo, al aumento de la mortalidad y aumento de costos de tratamiento y en caso de enfermedad crónica por la pérdida de la ganancia de peso (GDP).

La forma sobreaguda de la enfermedad se caracteriza por muerte súbita sin signos clínicos previos, cerdos cianóticos y secreción espumosa teñida de sangre en fosas nasales y boca. La forma aguda se caracteriza por la presencia de cerdos con marcada anorexia, apatía, decaídos, incluso tirados en el piso, disnea grave con golpeteo de flanco, hipertermia (temperatura mayor a 40°C) y cianosis en las extremidades. En estos casos la letalidad puede alcanzar al 100%.

La forma crónica, subclínica o subaguda se caracteriza por lotes poco uniformes respecto a la condición corporal, tos, dificultad respiratoria y menos apetito. Estos animales en general no mueren, pero su pérdida de GDP puede llegar a más de 40 gr/día y pasar de una conversión 3:1 a 3,4:1 o mayor, retrasando los días a mercado entre 10 a 20 días. Además de todo ello, estos cerdos son seguramente portadores del agente en tonsilas o en secuestros pulmonares, y cuando se interrumpe el tratamiento o caen los niveles de anticuerpos es muy probable que vuelva a aparecer la enfermedad.

Patogenia y respuesta inmune

La principal ruta de transmisión es el contacto directo, la transmisión por aerosoles a corta distancia es posible, pero poco frecuente. La transmisión entre piaras ocurre por la incorporación de animales portadores asintomáticos. La introducción de la enfermedad por inseminación artificial o transferencia de embriones es improbable y la transmisión a través de aves y roedores es dudosa y de poca importancia.

El período de incubación varía de unas pocas horas o días en casos agudos en donde la carga microbiana es grande -como en el caso de infecciones experimentales-, o meses en caso de infecciones naturales en animales sin sintomatología -donde la carga microbiana es baja-. Los animales que cursan con una forma crónica de la enfermedad pueden no presentar anticuerpos.

La respuesta inmunológica es fundamental para la protección frente a A. pleuropneumoniae. El microorganismo ingresa por las vías respiratorias superiores y como se dijo, coloniza las tonsilas, al ser las mucosas la primera vía de contacto, el papel de la IgA es importante en esta etapa pudiendo jugar un rol en la opsonización y neutralización de la bacteria incluso antes que ésta llegue al aparato respiratorio inferior. Después comienza a detectarse IgG en suero, una vez que el patógeno ya se ha adherido a los macrófagos alveolares y está produciendo toxinas. La importancia de la respuesta serológica en la protección ante la infección, ha estimulado la creación de vacunas más efectivas.

Es controvertido determinar el estado de colonización de los lechones, ya que el microorganismo se acantona en las criptas de las tonsilas y puede no existir respuesta serológica. En una piara en donde los animales de reposición propia no se infectan hasta llegar a sitio I, lo más probable que la seroconversión ocurra en los primeros ciclos reproductivos de las hembras.

Las madres juegan un rol muy importante, ya que pueden ser al mismo tiempo, la fuente de protección de los lechones, a través de los anticuerpos calostrales, y la fuente de infección de los mismos. En este sentido, se ha demostrado que cuando los niveles de anticuerpos son altos solo unos pocos lechones se infectarían y después ellos transmitirían la infección a sus compañeros de corral cuando caen los anticuerpos calostrales, lo cual que puede variar de  semanas a  meses

Los anticuerpos calostrales de los lechones comienzan a declinar entre 8 y 12 semanas de edad por lo que la mayor incidencia de la enfermedad se da alrededor de las 11 semanas de edad o más tarde. La caída de la inmunidad pasiva varía según el nivel de anticuerpos circulantes que las madres posean al momento de la lactancia de los lechones, el que se mantendrá estable mientras no ocurran desequilibrios debido a múltiples factores.

La transmisión entre piaras ocurre principalmente por la introducción de animales portadores asintomáticos, que constituyen el principal desafío diagnóstico para el veterinario de campo, ya que no presentan signología clínica y pueden dar resultados falsos negativos a las técnicas de laboratorio utilizadas de rutina para la detección del agente.

Lesiones pulmonares

La presentación clásica en cuadros agudos de PCP se caracterizan por lesiones fibrinosas y necróticas demarcadas que se ubican, generalmente, en el lóbulo diafragmático, cardíaco y lóbulos apicales. Los septos interlobulares, están engrosados y edematosos, y a veces se observan grandes hemorragias debajo de la pleura. Las zonas necróticas por lo general son oscuras y consolidadas. Además la tráquea presenta espuma sanguinolenta y a la inspección los bronquios están distendidos y los linfonódulos mediastínicos se aprecian con evidente aumento de tamaño y aspecto edematoso. Además, es común observar una pleuritis fibrinosa, especialmente en los lugares neumónicos. Los cerdos crónicamente infectados presentan adherencias pleurales, que son delimitadas por áreas de necrosis. También es posible encontrar numerosos secuestros que pueden variar en tamaño.

Las lesiones microscópicas más prominentes se observan en el parénquima pulmonar y la pleura. Éstas se caracterizan por una necrosis pulmonar de manera irregular, demarcada por un intenso infiltrado basófilo predominantemente mononuclear. Los vasos sanguíneos y los capilares se presentan intensamente congestivos. Es posible observar, con frecuencia, hemorragias en el espacio alveolar. El edema, por lo general, es intenso, demarcando los septos y llenando los alvéolos. Los vasos linfáticos también se encuentran distendidos con líquido edematoso y las trombosis son frecuentes en vasos sanguíneos de mediano calibre. Además, se pueden ver micro-colonias de bacterias en los alvéolos infectados. Los cambios celulares observados consisten en una acumulación de linfocitos en el fluido edematoso y en los septos interlobulares, como también la llegada masiva de neutrófilos y macrófagos.

El agente

Existen 2 biotipos A. pleuropneumoniae, el biotipo I, β-Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) dependiente y el II no dependiente del NAD. El biotipo I presenta 14 serotipos y el biotipo II, solamente 2 serotipos. Los serotipos 1, 2, 3,  y 5 fueron identificados en 1978, luego el serotipo 5 fue dividido en 5a y 5b, después fueron identificados los serotipos restantes. Hasta 2017 había descriptos 16 serotipos, sin embargo estudios muy recientes han propuesto dos serotipos más, el 17 y 18. Para complicar el panorama, de los serotipos tradicionales, el 2, 4, 7 y 9, pueden también ser del biotipo II (atípicos) y el serotipo 13 puede ser también del biotipo I. Los serotipos 16, 17 y 18 pertenecen al biotipo I, aunque puede haber cepas del serotipo 17 pertenecientes al biotipo II. Otras especies de Actinobacillus NAD dependientes colonizan la cavidad nasal y las tonsilas de los cerdos, como el Actinobacillus minor, Actinobacillus porcinus, Actinobacillus indilocus y Actinobacillus porcitonsillarum y si bien tanto su identificación como su rol patogénico es controvertido la presencia de los mismos pueden confundir y o entorpecer el diagnóstico de A. pleuropneumoniae.

La especificidad serológica se da por polisacáridos capsulares (CPS) y lipopolisacáridos (LPS), pero dado que algunos serotipos son similares y presentan cadenas iguales o similares de LPS es que existe reacción cruzada entre algunos serotipos: 1-9-11; 3-6-8-15 y 4-7, incluso también con algunas de las especies pertenecientes al grupo minor-porcitonsillarum. Además, existen cepas que presentan los CPS de un serotipo y los LPS de otro. Estas cepas complican el diagnóstico serológico porque presentan reacciones cruzadas atípicas.

A. pleuropneumoniae consta de muchos factores de virulencia que podrían clasificarse, en base a la interacción con el tracto respiratorio inferior, en aquellos factores involucrados en la adhesión, en la adquisición de nutrientes esenciales, la inducción de lesiones, la evasión de la respuesta inmune del hospedador y la persistencia de la infección

En referencia a los factores de virulencia involucrados en la inducción de lesiones, sin dudas que las exotoxinas formadores de poros en la membrana citoplasmática de células como neutrófilos y macrófagos alveolares son las de mayor importancia. Son 4 las toxinas que produce el microorganismo. Apx I, Apx II y Apx III son excretadas in vivo e in vitro y las tres son citotóxicas en diferente grado para los macrófagos, polimorfonucleares (PMNs), células epiteliales del pulmón y células endoteliales, además Apx I y Apx II son hemolíticas. La toxina Apx IV es producida por los 15 serotipos y sólo se excreta in vivo aunque se ha demostrado que existen cepas capaces de no producirla.

 No todos los serotipos son igualmente patógenos, así desde hace tiempo los serotipos 1, 5, 9 y 11 han demostrado ser los más patógenos tanto en infecciones experimentales como en situaciones a campo. Más allá de lo informado tradicionalmente en cuanto a la mayor o menor virulencia de los diferentes serotipos, también se ha observado que los mismos serotipos pueden comportarse diferencialmente según distintas situaciones, por lo que se ha indicado que otros factores además de la virulencia per se son necesarios para la aparición de casos clínicos a campo.

Diagnóstico

Aislamiento

A. pleuropneumoniae crece en agar sangre o agar chocolate con estría de Staphylococcus aeurus o Sthaphylococcus epidermidis que provea NAD a los serotipos que lo requieran. Crece también en otros medios suplementados cuando se trabaja a partir de muestras de casos sobreagudos, agudos o subagudos. La identificación por aislamiento puede ser confusa y complicada en casos crónicos. El verdadero desafío es identificarlo en animales portadores asintomáticos, en donde la muestra de elección es la tonsila, ya que este sitio está colonizado por muchas otras bacterias que entorpecen el correcto aislamiento e identificación del A. pleuropneumoniae. El aislamiento bacteriano es poco viable en estos animales que son los principales responsables del contagio de granjas libres de la enfermedad.

Algunas variantes en los medios de cultivo han sido sugeridas, con el agregado de extracto de carne, antibióticos y demás, pero en nuestra experiencia, no han satisfecho los resultados esperados. Otros métodos de aislamiento más costosos y sofisticados, como el aislamiento inmunomagnético ha sido descripto para algunos serotipos y ha demostrado ser más sensible que el aislamiento convencional, pero su utilización no ha sido muy difundida en los laboratorios de diagnóstico de rutina, probablemente debido a los costos.         En ambos casos el tratamiento antibiótico de los animales dificulta aún más la utilización de esta técnica.

Serología

Las pruebas serológicas se utilizan en todo el mundo para el diagnóstico de la PCP en complemento con el aislamiento del patógeno. El éxito en el control de A. pleuropneumoniae descansa en un diagnóstico rápido y exacto. Así, por ejemplo, en casos agudos el diagnóstico es relativamente fácil, ya que se basa en el reconocimiento de los síntomas, lesiones a la necropsia y el aislamiento de la bacteria. Sin embargo, en animales que poseen infecciones crónicas o subclínicas, el diagnóstico se basa, casi completamente, en el reconocimiento de anticuerpos séricos. Con respecto a los niveles de anticuerpos en los diferentes animales, éstos varían según el estado sanitario e inmunidad de masa que posea la granja.

Como se mencionó anteriormente, A. pleuropneumoniae es una bacteria que presenta una complejidad particular debido a la existencia de varios serotipos. Es así como en una misma granja pueden coexistir varios serotipos y otras bacterias relacionadas en animales portadores, que son la fuente de contaminación de piaras negativas a la enfermedad. Todo lo anterior, convierte al diagnóstico serológico en una valiosa herramienta.

Algunas de las pruebas serológicas que se han utilizado en la detección de anticuerpos anti- A. pleuropneumoniae son: fijación del complemento, precipitación en gel o inmunodifusión, aglutinación en placa y en tubo, hemoaglutinación indirecta y ELISA. Muchos de estos ensayos se basan en el uso de la célula bacteriana entera o extractos crudos de bacterias como antígeno. Estos extractos contienen proteínas y con frecuencia polisacáridos constituyentes bacterianos, muchos de los cuales son comunes a los diferentes serotipos de A. pleuropneumoniae y su uso no permite diferenciar entre serotipos.

La prueba de ELISA es la técnica más usada en los laboratorios de diagnóstico. Varios formatos de ELISA basados en LPS, antígenos capsulares y proteínas recombinantes de A. pleuropneumoniae han sido mostrados como específicos para determinados serotipos. Sin embargo existen algunos formatos incapaces de  discriminar entre algunos serotipos o incluso puede haber reacción cruzada con otras especies de la familia Pasteurellaceae como Actinobacillus suis, Actinobacillus rossi y Actinobacillus porcitoncillarum. En el 2004, se desarrolló un ELISA indirecto utilizando la exotoxina ApxIV recombinante, que presenta la particularidad de ser producida por todos serotipos, lo que permitiría identificar a los animales enfermos agudos y crónicos con A. pleuropneumoniae. Si bien es uno de los kits más ampliamente usados en nuestro medio, presenta algunas desventajas ya que i) no discrimina entre los distintos serotipos existentes por lo que indefectiblemente debe ser utilizado otro test para determinar el serotipo actuante, ii) puede dar resultado falsos negativos en animales portadores asintomáticos o en animales infectados con cepas que no expresan la proteína y por ende no se producen anticuerpos contra la misma.

La serología, particularmente el ELISA, a pesar de ser una herramienta diagnóstica de elección para determinar lo que ocurre en las piaras, puede requerir cautela en la interpretación de los resultados debido al hecho de que no todos los animales seroconvierten y la poca sensibilidad de las técnicas.

Técnicas de detección in situ

La inmunohistoquímica, la inmunofluorescencia y la hibridación in situ permiten estudiar la relación del agente con las células y tejidos que afecta, lo que demuestra su gran utilidad en investigación, no así para el diagnóstico de rutina, por ser técnicas laboriosas y costosas.

PCR y LAMP

En la actualidad existen disponibles en las bases de datos 26 genomas completos de casi todos los serotipos de A. pleuropneumoniae. Esta información ofrece  un gran repertorio de secuencias blanco para el diseño de herramientas diagnósticas moleculares. Muchos formatos de PCR de primera y segunda generación han sido estandarizadas para identificar y cuantificar A. pleuropneumoniae, a partir de una gran variedad de muestras clínicas. También han sido descriptos varios formatos de la técnica amplificación isotérmica de bucle (LAMP, por sus siglas en inglés) que en nuestra experiencia en laboratorio ha demostrado mayor sensibilidad respecto a la PCR de punto final.

Identificación de serotipos mediante técnicas moleculares

La serotipificación de aislamientos de campo de A. pleuropneumoniae es un factor clave en el estudio epidemiológico y el control de la enfermedad. Debido a que la prevalencia y virulencia de los diferentes serotipos no son los mismos y varían de un país a otro,  incluso dentro de una región y hasta el mismo serotipo puede comportarse distinto, es importante determinar correctamente el serotipo de la cepa que está siendo aislada de los animales. Varias técnicas han sido descritas para determinar los serotipos e incluyen la  aglutinación en tubo, inmunofluorescencia, inmunodifusión, aglutinación en placa, prueba de aglutinación en tubo con 2-mercaptoetanol, precipitación en anillo, hemaglutinación indirecta, coaglutinación y  fijación del complemento.  Con el advenimiento de nuevas tecnologías como la PCR, la tipificación se puede realizar mediante la amplificación de segmentos de ADN específicos de los serotipos ya sea en formato multiplex de uno o varios genes o en formatos uniplex para determinados serotipos.

Control

 El control de la PCP se realiza principalmente mediante la optimización de las prácticas de manejo, medicación antibiótica y la vacunación.

Antibióticos

A. pleuropneumoniae es susceptible in vitro a penicilina, ampicilina, cefalosporinas, cloranfenicol, colistina, sulfonamidas, trimetoprim-sulfa, gentamicina y tilmicosina a la que tiene una baja concentración inhibitoria minima (CIM). Altos valores de CIM se han encontrado para estreptomicina, kanamicina, espectinomicina y lincomicina. Aunque los antibióticos β-lactámicos (penicilina, ampicilina, amoxicilina) normalmente muestran una buena actividad contra el microorganismo, se han informado casos de resistencia esporádicos. La resistencia parece ser frecuente en algunos serotipos más que en otros.

Los antibióticos que se consideran más activos son aquellos que tienen la más baja CIM y las propiedades farmacocinéticas más satisfactorias. En consecuencia, los β-lactámicos (penicilina, principalmente, y cefalosporinas) y cloranfenicol son considerados como los más activos. La enrofloxacina y el ceftiofur han demostrado ser especialmente eficaces después de la inoculación experimental y a campo, en donde también se han informado resultados satisfactorios usando tiamulina y una combinación de lincomicina y espectinomicina.

En el caso de PCP la terapia con antibióticos es eficaz en animales clínicamente afectados y sólo en los que están en la fase inicial de la enfermedad puede reducirse la mortalidad. Algo importante de resaltar en este sentido es que, a estos animales,  los antibióticos deben administrase de forma parenteral ya que los animales afectados no comen ni beben. El éxito del tratamiento depende principalmente de la detección precoz de los signos clínicos y en la intervención terapéutica rápida. En distintos países la medicación estratégica o pre-medicación sistemática en cerdos en crecimiento ha sido usada para controlar, y en algunas instancias, para eliminar enfermedades, incluyendo la PCP. Esta estrategia se basa en la administración de altas dosis de antibióticos por cortos períodos durante la fase de desarrollo de la enfermedad, reduciendo la prevalencia y la severidad de la misma a niveles subclínicos o muy bajos. Sin embargo, debido a la resistencia a determinados antibióticos y las rígidas legislaciones de países del primer mundo hacen que cada vez el uso de antibióticos sea más restringido.

El tratamiento con antibióticos no elimina el estado de portador asintomático, al menos utilizando las drogas disponibles hasta el momento.

Vacunas

El uso de bacterinas puede reducir la mortalidad después de una infección con el serotipo homólogo, pero generalmente no sucede lo mismo con serotipos heterólogos. Esta protección limitada se debería al hecho de que en las bacterinas no existen toxinas Apx ni otros factores de virulencia. El uso de vacunas a subunidades, que contienen los toxoides Apx mejoraría esta protección cruzada entre serotipos heterólogos y además disminuiría la severidad de los síntomas clínicos y mejoran la performance de los animales, sin embargo no son los únicos factores que estimulan al sistema inmune, ya que el microorganismo necesita primero adherirse y luego produce las toxinas.

Los mecanismos de adhesión de los microorganismos están siendo estudiados intensamente en las últimas décadas, pero aún no se conocen lo suficientemente bien. En el caso de A. pleuropneumoniae y en referencia a las vacunación, se ha demostrado que vacunas preparadas con cepas que in vitro tenían una adherencia fuerte, inducían mejor protección que aquella vacuna preparada con cepas que in vitro tuvieron una adhesión leve.

Considerando los muchos factores de virulencia que tiene A. pleuropneumoniae y que para una vacuna más efectiva podrían combinarse varios de ellos, ha sido demostrado que vacunas que contenían toxinas Apx y proteínas unión de transferrina (Tbp) indujeron mejor protección que aquellas que contenían toxinas Apx solamente.